出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不*互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn),酶量過多有時(shí)也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有:必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有:減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。
克隆PCR產(chǎn)物1)克隆PCR產(chǎn)物的優(yōu)條件是什么?
摩爾數(shù)比1:8或8:1也行。應(yīng)測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí),或4℃過夜。在這2種溫度下,缺T-凸出端的載體會自連,產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求,為提高連接效率,需4℃過夜。
2)PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化?
如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶,不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶,可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高,這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆,而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。
3)如果沒有回收到目的片段,還需要作什么對照實(shí)驗(yàn)?
A)涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。
如有菌落,表明氨芐失效,或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒,或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。
B)轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒,計(jì)算菌落生長數(shù),測定轉(zhuǎn)化效率。
例如,將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后,用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜,產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為: 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。
鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA,用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA,用1/10鋪板,共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為:
1000克隆X10(3次方) ng /鋪板1 ng DNA ug=10(6次方)cfu/ ug
轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10(8次方)cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞
如沒有菌落或少有菌落,感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。
C)如用pGEM-T正對照,或PCR產(chǎn)物,產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑(用步驟10(8次方)cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞),表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶(M1801,M1804,M1794)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染,不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。
D)用pGEM-T或pGEM-T Easy載體,連接pGEM-T正對照,轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞(10(8次方)cfu/ug),按照的實(shí)驗(yàn)步驟,可得100個(gè)菌落,其中60%應(yīng)為白斑,如產(chǎn)生>20-40藍(lán)斑, 沒有菌落或少有菌落,連接有問題。
4)對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好,卻沒有回收到目的片段,實(shí)驗(yàn)出了什么問題?
A)連接用室溫保溫1小時(shí),能滿足大多數(shù)克隆,為提率,需4℃過夜。
B)插入片段帶有污染,使3`-T缺失,或抑制連接,抑制轉(zhuǎn)化。為此,將插入片段和pGEM-T正對照混合,再連接。如降低了對照的菌落數(shù),插入片段需純化,或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。
C)插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段,因受UV過度照射,時(shí)有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體,不利于連接,DNA必需重新純化。
D)帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料(TM042)。
E)高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定,在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排,如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排,需用重組缺陷大腸桿菌菌株,如SURE細(xì)胞
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