核酸純化在分子生物學實驗室已經(jīng)廣泛應用。怎樣獲得高質(zhì)量、高純度的DNA或RNA樣品對下游實驗的順利進行至關重要,因此,對純化后的核酸進行鑒定也是*的步驟。本文簡單的回顧學習一下核酸鑒定的方法。
核酸鑒定包括:濃度/純度鑒定+完整性鑒定
1.濃度/純度鑒定
(1)紫外分光光度計:
原理:由于核酸中的堿基都具有共軛雙鍵,所以具有紫外光吸收性質(zhì)。核酸在紫外光譜區(qū)有一條典型的吸收曲線,其吸收高峰在260nm處,吸收低谷在230nm處。蛋白質(zhì)在紫外區(qū)的吸收高峰在280nm處,所以核酸的紫外吸收光譜數(shù)據(jù)是鑒定核酸的重要依據(jù)之一。
由于核苷酸zui大吸收波長為260nm,根據(jù)朗伯-比爾定律可計算出在波長260nm的紫外線下,1個OD值的光密度大約相當于50µg/ml的雙鏈DNA, 40µg/ml的單鏈RNA。紫外分光光度法只適用于測定濃度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
計算公式:
dsDNA(µg/µl)=OD260x50x稀釋倍數(shù)/1000
RNA(µg/µl)=OD260x40x稀釋倍數(shù)/1000
純凈的DNA OD260/OD280=1.8,制備的樣品DNA比值在1.7-1.9,若洗脫時不使用洗脫緩沖液而使用去離子水,比值會偏低,因為PH值和離子存在會影響光的吸收值。
當OD260/OD280< 1.7,表明蛋白質(zhì)含量較高,可用利用酚、異戊醇抽提,再用乙醇沉淀去除。
當OD260/OD280> 2.0,表明RNA含量較高。可用RNaseA消化后再進行純化。
OD260/OD230的值,一般不小于2.0,若小于2.0,表明有碳水化合物、鹽類或有機試劑污染。
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